N—乙酰—5—羟色胺对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用

　　【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2018）03-0-01
　　视网膜缺血再灌注损伤是眼科临床常见的病理生理过程，严重影响患者的视觉功能[1]。缺血再灌注损伤的发病机制尚未明确，有研究证实视网膜缺血再灌注损伤与细胞凋亡有密切的关系[2，3]。N-乙酰-5-羟色胺（N-acetylserotonin，NAS）是一种自由基清除剂，对肝细胞、脑细胞的氧化损伤具有保护作用[4]。有研究证实NAS可增加肝微粒体膜的稳定性，课题组前期研究证实NAS可减轻肝缺血再灌注损伤小鼠肝脏结构的损伤，抑制肝细胞凋亡，改善肝脏功能[5，6]。但是近年来有关NAS对视网膜缺血再灌注的保护作用报道较少。本研究拟通过观察NAS对视网膜细胞缺血再灌注损伤的保护作用，为开发治疗视网膜缺血再灌注损伤的新药、提高视网膜缺血再灌注损伤的疗效提供实验依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 实验动物及分组 健康成年SD大鼠30只，体重300g左右，随机数字表法随机分为正常对照组（10只）、缺血再灌注组（10只）以及NAS组（10只），正常对照组不加干预，缺血再灌注组于造模前30min腹腔注射5mg/kg的生理盐水，NAS组于造模前30min腹腔注射5mg/kg的NAS。
　　1.1.2 主要试剂 NAS（Sigma公司，美国）；HE染色试剂盒（碧云天生物技术有限公司，海门）；兔抗大鼠Bcl-2、兔抗大鼠Bax（Abcam公司，美国），免疫组化试剂盒（博奥森公司，北京）、DAB显色剂（中杉金桥生物技术有限公司，北京）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 RIRI模型制作 按照文献报道，采用右眼生理盐水前房加压灌注法制作视网膜缺血再灌注模型[7]。
　　1.2.2 组织切片制作 各组大鼠于RIRI 72 h后取眼球组织，4%多聚甲醛固定，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，将包埋好的标本平行于视神经矢状轴进行切片，切片厚约4μm。
　　1.2.3 HE染色 石蠟切片脱蜡至水，苏木素液染色，双蒸水冲洗，1%盐酸酒精分化，双蒸水冲洗，梯度酒精脱水，伊红染色，95%盐酸酒精分色，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。
　　1.2.4 免疫组织化学染色 90?C烤片2h，常规脱蜡至水，枸橼酸盐抗原修复，3%H2O2消除内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，加入兔抗大鼠Bcl-2（1：500）和兔抗大鼠Bax（1：500）一抗并4?C孵育过夜，PBS缓冲液冲洗，加入二抗，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察结果。
　　1.3 统计学方法 实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 10.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 HE染色结果 正常对照组大鼠视网膜结构清晰，各层细胞排列紧密；缺血再灌注组大鼠视网膜各层高度水肿，神经节细胞逐渐减少且分布紊乱；NAS组较缺血再灌注组细胞水肿明显减轻，细胞排列趋于规整，神经节细胞数量减少程度有显著缓解。
　　2.2 各组大鼠视网膜Bcl-2蛋白表达的变化 正常对照组视网膜可见大量Bcl-2阳性细胞，细胞数为1580±23.75个·mm-2；缺血再灌注损伤组Bcl-2阳性细胞显著下降，细胞数为845±17.89个·mm-2；NAS组Bcl-2阳性细胞数为1258±18.45个·mm-2，显著多于缺血再灌注组，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　2.3 各组大鼠视网膜Bax蛋白表达的变化 正常对照组大鼠视网膜Bax阳性细胞较少，细胞数为98.75±15.98个·mm-2；缺血再灌注组Bax阳性细胞数为869.78±18.97个·mm-2；NAS组Bax阳性细胞显著少于缺血再灌注组，为125.85±28.49个·mm-2，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　3 讨论
　　N-乙酰-5-羟色胺（N-acetylserotonin，NAS）是一种自由基清除剂，对肝细胞、脑细胞等氧化损伤均具有保护作用[8]。SHAHAR等建立大鼠肠缺血再灌注损伤模型，观察NAS对缺血再灌注后肠道细胞的保护作用，证实NAS可以抑制大鼠肠缺血再灌注损伤后细胞凋亡，有效预防肠黏膜损伤[9]。课题组前期研究发现NAS可减轻肝缺血再灌注损伤小鼠肝脏结构的损伤，改善肝脏功能，抑制肝细胞的凋亡[4]。本实验将NAS用于大鼠RIRI模型中，通过观察大鼠视网膜结构的变化以及Bcl-2蛋白和Bax蛋白的改变，研究NAS对大鼠RIRI后视网膜神经细胞的保护作用。
　　HE染色结果证实正常对照组大鼠视网膜结构清晰，各层细胞排列紧密；缺血再灌注组大鼠视网膜各层高度水肿，神经节细胞逐渐减少且分布紊乱；NAS组较缺血再灌注组细胞水肿明显减轻，细胞排列规整，神经节细胞数量减少程度有显著缓解。Bcl-2家族成员在凋亡过程中起着关键作用。Bcl-2是一种重要的抗凋亡蛋白，可阻断细胞色素C的释放，抑制下游凋亡反应，而Bax是促凋亡蛋白，通过与Bcl-2而封闭其活性，同时促进细胞色素C的释放促进细胞凋亡的发生[10，11]。本研究证实NAS组RIRI后Bcl-2阳性细胞显著多于缺血再灌注组，提示经NAS干预后Bcl-2蛋白表达上调。缺血再灌注损伤组RIRI后神经节细胞层及内核层可见Bax阳性细胞，NAS组Bax阳性细胞显著少于缺血再灌注损伤组，证实在NAS的作用下Bax蛋白表达降低。提示NAS抑制RIRI大鼠视网膜细胞凋亡的机制可能与促进Bcl-2蛋白表达并抑制Bax蛋白表达有关。
　　总之，NAS可促进RIRI后大鼠视网膜Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达，从而减轻细胞凋亡，具有一定的神经保护作用，为临床治疗RIRI提供了新思路和研究方法。

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